在许多生物过程中，已将可重复使用的部件和系统，纳入可清洁的替代方案。在许多情况下，其理由是来自于特定工艺的好处，如增加制造生物反应器灵活性--特别是对合同制造组织（CMOs）来说--增强无菌保证，消除清洗，减少资本投资，提高生产力而加快处理时间，更快启动，以及其他好处。
一次性使用技术在生物制药生产中应用的一个关键因素，是需要设计和开发完全满足用户工艺系统的性能、功能和验证要求的部件。对于复杂的设备来说，满足这一要求尤其困难，例如生物反应器。在此，我们将讨论如何从系统工程的角度来解决这一挑战。
设计想法
当设计一个现有可清洁部件的一次性替代品时，一个简单的方法是采用一次性材料开发一个具有类似外形、配合和功能的版本。对于某些产品，这可能是可行的。例如，一个包含不锈钢外壳滤芯的消毒过滤系统，可以被一次性胶囊过滤器取代，该过滤器在塑料外壳内含有类似类型的滤芯（图1）。然而，为了提供预灭菌的一次性产品所需的抗伽马射线能力，即使在这个例子中，也可能需要修改滤芯的结构材料。
对于更复杂的部件，如生物反应器，可能需要从根本上改变设计和工程。这使产品设计师和开发人员有机会创造出新的设计，在提供诸如更快的系统设置和改善产品处理等实际好处的同时，提高传统可清洁系统的性能。
设计方法
设计这种生物反应器的首要考虑，是应用系统工程原则以确保稳健和可靠的性能。这种方法需要出色的生物过程、机械、生产和控制工程，以及人体工程学方面的考虑，以确保设备易于组装和有效操作。这可以通过考虑生物反应器及其附属设备的整体布局得到最佳遵循。通过关注对实现最终设计至关重要的个别部件（图2），可以引出不同的考虑。
- 生物容器的几何形状
大多数玻璃和不锈钢的生物反应器容器都是圆柱形的，后者设计有盘状的头部。这样的几何形状需要容纳高压蒸汽进行消毒，这些生物反应器是按照压力容器的标准设计的，要求有一个圆形的形状以增强机械稳定性。
因此，圆柱形容器成为生物反应器的标准几何形状。然而，越来越多的人在接受一次性使用技术和灵活的生物容器时，取消了原位蒸汽（SIP）和原位清洁（CIP）程序，为产品设计师提供了考虑替代几何形状的机会，并允许纳入可能证明对性能和其他功能有益的特征。
对一次性搅拌罐生物反应器最合适几何形状的评估，使L公司选择了一个方形的截面格式--横截面格式。我们青睐这种几何形状，不仅是因为其特定的生物工艺工程特点（如下所述），还有以下原因:
多年来，立方体一次性生物容器一直被用于单元操作，如存储、产品转移和混合等广泛的经过验证的制药过程。
L公司已经在制造、供应和验证立方体几何形状的生物容器方面获得了宝贵的经验。
- 生物容器处理和保护的人机工程学（图3）
用于建造搅拌罐生物反应器的单体中的柔性聚合物生物容器膜，在制造过程直到最后的安装和操作过程中，都可能被损坏。因此，L公司特别关注生物容器的几何形状、结构材料、接缝焊接和包装，以及作为一个集成单元的系统设计等特点。此外，设计团队融合了特殊的功能，以便安装和操作，并消除了操作错误的风险。
在这个开发项目中，很明显，立方体的生物容器比圆柱体的格式更易折叠、保护和包装，有助于确保生物容器在制造、运输和安装过程中的最高完整性。立方体形状还呈现出明显的面，这有助于从安装到支持硬件时指导生物容器的正确对齐和定位。支撑硬件和生物容器的设计，是为了实现简单的安装和生物容器的充气，尽量不需要操作员进行调整，消除了手工操作和操作员错误造成的固有损害风险。
另一个关键要求是防止生物容器薄膜和其他系统部件之间的接触，这使得外部刚性保护元件成为必要。例如，CELLPIE Uniform-S 平台（货号GLE-6）系统包括一个刚性的盖子，以在运输和安装过程中保护其叶轮不会损坏薄膜。此外，底部进入的叶轮形式，帮助工程师设计了紧凑且兼具保护性能的生物容器包装，使叶轮和组件不会损坏生物容器。
这些生物反应器的设计，使其能够由不超过两名操作员完成安装和充气，并有步骤说明和彩色编码的数字标签来指导他们完成这一过程。最小的操作者干预，减少了意外损害的风险，前门完全打开，以便在安装过程中容易进入。为防止生物反应器在充满液体时意外打开，门锁的控制是基于液位的。在有条件的地方加入一次性使用的传感器，以消除安装、清洁、消毒和校准检查。对于可重复使用的探头，波纹管被设计为无菌式插入。
特色功能
- 叶轮系统
为了满足生物过程的需求，叶轮的选择对生物反应器的设计至关重要。这个部件能够将足够的动力传入细胞培养基，以实现充分的质量传递，满足细胞的氧气需求，同时保持良好的介质混合和均匀性。在这种情况下，叶轮系统的设计和位置必须既能满足与使用立方体生物容器相关的人体工程学，又能方便安装和包装。
- 叶轮类型
首选叶轮类型是螺旋桨叶设计（图4）。这种类型在用于动物细胞培养的生物反应器中很常见，因为它被认为在最佳叶片直径和搅拌速度下，不太可能造成剪切损伤，具有适当叶片配置的叶轮还能平衡轴向和径向流动。
- 叶片的几何形状
该叶轮的几何形状是专门为优化立方体生物反应器的性能而设计的。三个叶片的大面积和45°俯仰角产生了一个强大的上流，用于高效空气分散和气体再循环，这一特性对于需要高速率的氧气质量转移和二氧化碳剥离的密集细胞培养来说特别重要。
- 叶轮直径
叶轮直径与生物反应器边长的比率（D/T）是一个重要的参数（图5），它影响到f低模式和功率输入。对于200-L的CELLPIE Uniform-S 平台（货号GLE-6）系统，D/T比率被设定为0.5，对于给定的特定功率输入（W/kg），确保混合时间比小叶轮短。在控制pH值的过程中，均匀性得到了改善，而且喷出的空气可以更有效地进行分散。
- 叶轮间隙
叶轮间隙(C)的比例在生物反应器底部（图4）与生物反应器中的流体高度（H）之间的关系，会影响流动模式和混合。混合系统中的C/H比率，通常在1/3-1/6之间。对于CELLPIE Uniform-S 平台（货号GLE-6）200生物反应器，考虑到在最小（60L）和最大（200L）工作容积时，需要保持良好的轴向流动和充分的混合，1/4的比例被确定为最佳值。
- 泵送方向
能够操作叶轮进行上流或下流泵送是一个重要的要求，并通过一个双向驱动电机设计到这个系统中。45°倾斜叶片的叶轮，要确保在任何方向都有相同的泵送速率。对于大多数动物细胞培养，CELLPIE Uniform-S 平台（货号GLE-6）生物反应器将被编程为上流泵，但它的下流能力可使微载体上的粘附细胞培养受益，使微载体在低速下悬浮，且具体的功率输入较低。
- 驱动系统
对于这个叶轮的驱动系统，设计团队选择了一个底部进入的驱动轴，底部进入的短轴减少了动力下的弯矩，对驱动轴的轴承和无菌屏障的动态密封压力较小。如上所述，较短的轴还可以使包装更加紧凑，是以将容器的损坏风险降到最低。
- 速度和特定功率
CELLPIE Uniform-S 平台（货号GLE-6）200叶轮驱动系统设计，用于控制高达150rpm的转速。在该生物反应器的鉴定研究中，功率值(P)的测量是使用一个旋转扭矩传感器，该传感器安装在叶轮和马达之间的生物反应器轴。研究小组测量了叶轮在空气中旋转所耗散的功率，将该值减去它在37℃的200L水中旋转所得到的值，以确定耗散到液体中的真正功率。
结果显示，在150转/分的上流模式下，获得了0.31W/kg的特定功率输入（表1）。该特定功率水平明显高于一般用于满足目前可实现的电池密度质量转移要求。鉴于特定功率和kLa之间的关系，它应该确保CELLPIE Uniform-S 平台（货号GLE-6）系统能够满足那些目前的质量转移要求，以及更高的水平。1,000-L生物反应器显示出类似的特定功率值，2,000-L生物反应器的特定功率稍低，但它们的kLa值相似，因为在标准条件下，每分钟每体积液体的等效最大空气体积（VVM）值被保持，所以决定kLa的线速度更高。
- 生物容器中的顶空体积
表述为容器总体积的百分比，圆柱形生物反应器的顶空体积通常在20-30%之间。设计人员将顶空体积设定为约25%，这为高滞留（和可能的泡沫）提供了足够的余量，与高特定功率和曝气率有关。
- 挡板
对生物工艺工程要求的初步评估表明，良好的工艺性能，需要防止与大多数没有挡板的不锈钢和一次性生物反应器相关的强烈漩涡。方形大大减少了漩涡，但与圆柱形设计一样，也需要某种形式的挡板。因此，该团队在不锈钢支撑硬件中设计了三个突出的垂直金属板。在生物容器的自动充气过程中，这些板形成了生物容器壁向内突起的有效挡板，这样的设计消除了在制造过程中，对柔性侧壁进行定制成型和焊接的需要，最大限度地提高了生物容器的强度、完整性和坚固性。
这些金属板的设计和由此产生的内部挡板轮廓，连同生物容器的方形形状，产生的流动模式可与传统的挡板式圆柱形生物反应器相媲美，这种流动模式已在随后的鉴定研究中得到证实。CELLPIE Uniform-S 平台（货号GLE-6）生物反应器的测试还表明，即使在较高的特定功率输入（P/V≤0.31W/kg）和搅拌速度（≤150rpm）的漩涡流和涡流带来的气泡夹带仍然是最小的，这些流动模式和P/V值确保了优良的均匀性和传质特性。
- 纵横比
长宽比H/T=1的立方体生物容器与长宽比>1的圆柱体格式体积相似（图6）。因为长宽比>1会导致顶面的均匀性差，立方体格式的低长宽比和其减少的液体高度提供了更好的混合，这样的改进对于高细胞密度培养中与pH值控制有关的局部pH值峰值特别有益。
此外，低长径比增加了液体表面积与体积的比率，因此立方体格式提供了更大的顶空传质能力。在某些应用中，这可以消除在运行开始时连续喷气的需要--例如，如果一个细胞系（特别是在微载体应用中）容易受到喷气和气泡破裂的损害，尽量少的喷气也有利于干细胞培养的氧气需求。此外，更大的表面积加强了二氧化碳的剥离。
最后，低长宽比通过最大限度地减少高空作业问题提供了人体工程学的优势，例如，与手工操作生物反应器顶部的管子、固定装置和配件有关的问题，或在头部空间减少的区域工作。
- 喷雾
关于喷气系统的设计和低容量，考虑到为实现所需的氧气传质率而需要足够的低空气，以及有效的二氧化碳剥离要求。必要时，后者在很大程度上取决于喷气低速率。因此，设计了一个具有适当大小和数量的端口的环形增压器，以实现高的f低率（≤0.2vvm），而且没有过多的线速度。该系统产生相对较大的气泡，与小气泡相比，不太可能损害细胞，同时通过足够kLa O2的比功率和加料速率保持高氧传输。对于CELLPIE Uniform-S 平台（货号GLE-6）系统，即使是最低的最大值（表2）--对于迄今为止的大多数细胞培养过程来说也是绰绰有余的。
对于高pCO2水平，在CELLPIE Uniform-S 平台（货号GLE-6）生物反应器中喷气（通过环形或可选的开放式管道喷气），在通气率≤0.1vvm时产生3-6 mol/L/d的高CO2剥离率。此外，由于最佳的二氧化碳水平因细胞系而异，所以在广泛的细胞培养应用中，几何学可以为有效的二氧化碳剥离和控制pCO2提供更大的机会。再加上一个独立的明管增压器，生物反应器中的高kLaO2值消除了对微增压器的需求。后者不仅会导致高pCO2值，而且还会增加泡沫的产生和小气泡对细胞的损害，从而对细胞生长产生负面影响。
- 容器的通风
当用一次性使用的柔性薄膜低压容器取代可蒸汽灭菌的压力等级生物反应器时，必须重新仔细评估通风要求。不锈钢生物反应器的喷射可以产生泡沫、气溶胶介质和冷凝水蒸汽，这些都可以在疏水性的通风口积聚。过滤器可能会限制空气流动，增加生物反应器内的压力。在额定压力的不锈钢系统中，压力的增加是可以容忍的，适度的背压可能不会严重影响加注和细胞培养性能。然而，对于一次性使用的低压系统，必须通过修改通风过滤系统来防止背压。
为了确保生物容器中的背压最小，选择了能在最大喷气速率下提供低压差的通风过滤器。通风过滤器的加热套也被开发出来，放置在过滤器周围，使其保持足够的温度。温度升高，以蒸发所有进入过滤器外壳的液体。
疏水通风过滤器通常包含一个褶皱的聚四氟乙烯（PTFE）消毒级膜，但是这种过滤器不适合一次性使用系统，因为聚四氟乙烯不能抵抗系统消毒所需的伽马射线。出于这个原因，通风过滤器是由抗伽马辐射的褶皱PVDF膜制成。
为了确认通风口过滤系统的适用性，在最坏工艺条件和最大f低速率条件下，进行了≤45天连续使用的过滤器寿命测试。结果显示，没有出现过滤器堵塞或与冷凝物有关的压力积聚。
- 可扩展性
使一次性生物反应器系统具有可扩展性，是本设计和开发项目的一个特殊挑战。L公司专注于关键的扩展参数，如特定功率输入、质量传递、长宽比和剥离。测量和控制系统需要确保细胞在这些生物反应器中所经历的条件，在不同的尺寸之间尽可能地相似。
在CELLPIE Uniform-S 平台（货号GLE-6） 200和1000系统以及10-L可重复使用的玻璃生物反应器中，使用中国仓鼠卵巢悬液（CHO-S）细胞系的比较研究显示，所有三个系统在细胞密度和活力、单克隆抗体（MAb）生产率、pH值和DO2控制、葡萄糖消耗和其他方面的性能相似，操作参数和培养性能都与该细胞系密切匹配，并落在所需的范围内，证实了一次性使用系统的可扩展性，最高容量为1,000L。CELLPIE Uniform-S 平台（货号GLE-6） 产品系列的基本设计和工程特点，现在已经扩展到2,000L容量的系统。表3总结了CELLPIE Uniform-S 平台（货号GLE-6）系统的工程参数。
比较立方体和圆柱体生物反应器
使用立方体而不是圆柱体的生物反应器。如上所述，圆柱形生物反应器具有某些基本优势。为了证明这两种类型的混合情况相似，在CELLPIE Uniform-S 平台（货号GLE-6） 200生物反应器上进行了计算流体动力学（CFD）建模研究。容器的几何形状是用Ansys DesignModeller参数化几何软件创建的，并使用Ansys网格工具进行网格划分，得到的网格被导出到Ansys Fluent程序中进行计算。两种几何形状的混合模拟，使用相同的叶轮，具有类似的挡板尺寸和长宽比（表4）。
- 流动模式
图7显示了立方体几何形状的预测流量模式。叶轮排出在上流模式下，流体以45°角流动。当这些液体撞击生物容器壁时，一些液体以相对较低的速度被驱赶到表面，而其余的则向下发散，有大量的液体被叶轮吸回。
这些模式表明在叶轮下方有轴向和径向的分散，但在叶轮上方主要是轴向分散。在立方体和圆柱体的几何形状中，叶轮顶端都有轨道流体存在。 对于圆柱体几何形状，预测在100rpm时有类似的f低模式（图8）。低频模式与实验中发现的上流式宽叶片 "象耳 "叶轮非常相似。
- 混合时间
在建立一个模拟的f低场后，根据在流体表面的特定位置加入100mL的氯化钠示踪剂溶液进行混合模拟。计算了示踪剂的后续分布，混合时间为定义在两个虚构探针的位置上，液体达到95%的均匀性所需的时间（图9）。
只看到微小的差异在50rpm和更高的转速下，立方体和圆柱体生物反应器之间的混合时间。对于一个200L的立方体系统，CFD预测的混合时间与实验研究中使用电导率方法得到的混合时间非常相似，除了最慢的25rpm速度（图10），实验结果与圆柱形容器的预测时间更为一致。25r/pm的CFD结果离谱的原因尚不清楚，但是对于培养过程中的使用速度，CFD和实验结果是合理一致的。
搅拌时间也是在最大搅拌速度下，使用pH值方法对CELLPIE Uniform-S 平台（货号GLE-6）生物反应器的全部范围进行测量（图11）。从200L生物反应器到2000L生物反应器，混合时间从11.4s增加到16.0s，正如理论所预期的，在整个流体领域没有观察到死区。
- 叶轮功率数和具体输入功率
基于叶轮应力的CFD得到叶轮输入功率P的计算公式为：P=2πNM，其中N=叶轮旋转速度（r/s），而M= 叶轮扭矩（Nm），然后根据以下公式确定叶轮功率数：Po = P/(rN3 [D]5)，其中D = 叶轮直径（m）， r= 水的密度（kg/m³）。
计算出的Po值显示了200L立方体生物反应器和圆柱体生物反应器的全部搅拌速度，并与以下数据作了对比雷诺数，Re = rND2/µ（图12）。两个生物反应器形状的Re > ~104时，计算值相对稳定，因为它们应该是1.5的值。由于功率数取决于f低模式，这证实了两个生物反应器中模式的相似性。此外，计算出的功率数值与实验确定的值1.3很一致。根据扭矩计的读数，CELLPIE Uniform-S 平台（货号GLE-6）200生物反应器的功率为1.5kW。CFD和实验功率数之间的这种一致性是非常典型的。
从功率数来看，具体输入功率P/V(W/kg)可以被确定，这是特别令人感兴趣的，因为它通常变化不大，如果有的话，在不同的尺度上--它是氧气转移率和混合时间的主要决定因素。图13给出了200L立方体和圆柱体生物反应器的CFD值，这些数据显示<5%的差异。图14显示了实验值以及搅拌器的尖端速度。通过比较这两组数字，我们可以看到P/V在125rpm以下的变化<10%，在最大搅拌速度下的变化为16%。
解决CE损伤问题
细胞的剪切损伤通常与针尖速度或特定的功率输入有关。在生物反应器的细胞培养过程中，建议防止这种损伤，典型最大尖端速度是~1.5m/s。然而，没有理论原因或实验证据支持这个数值，一些研究人员报告的数值远远超过大规模的细胞培养，1.5m/s的速度不会对细胞造成损害。在200L的立方体生物反应器中，有更低的数值（图14）。由搅拌速度为100r/min可以得到尖端速度为1.5m/s，特定功率约为0.1W/kg，这远远高于文献中描述的成功大规模培养所需的P/V。
CELLPIE Uniform-S 平台（货号GLE-6） 200生物反应器的搅拌速度为80rpm，尖端速度为1.2m/s，在上流模式下的特定功率值为0.055 W/kg。在200L的培养体积中，使用了0.05vvm的通气速率。在这些条件下，可以获得高的细胞密度和存活率（图15）。此外，以1.8m/s的尖端速度进行的台式研究显示对细胞培养没有负面影响。
图16显示，在立方体1,000-L生物反应器中获得了同等的细胞培养性能。这些研究结果证实，驱动系统和叶轮设计以及工程，可以提供足够的搅拌和特定功率，以满足动物细胞培养应用的不同需求，并可能有更多的储备用于细胞回收培养。
对一系列细胞类型包括微载体上细胞损害的现代理论表明，当细胞大于Kolmogorov涡流尺寸（K）时，就会发生损害。K的值可以从CFD的计算结果中计算出来--平均能量耗散率和最大局部值与平均值的比率，它的数值很难用CFD精确计算出来，但这里使用的叶轮类型和D/T比的实验工作给出的数值是~15 。
计算K的关系描述为
其中v是运动粘度，¯εT是具体的功率输入，单位是W/kg（对于密度类似于细胞培养基的液体，1 W/kg = ~103 W/m³）。
为了防止损坏，显然K必须>~20μm。然而，在现有的最大速度下，¯εT = 0.4 W/kg 和λK = ~35 µm。因此，损害不应该发生。最近研究在数值高达1,000 W/m³的情况下，在一个案例中使用了一个双桨叶叶轮，另一个使用Rushton涡轮机，都显示包括糖基化在内产品的工艺性能和质量没有恶化。
潜在的损害总是存在的，现在的培养基有足够水平的Pluronic F-68表面活性剂来防止这种损害，所以这也应该是没有问题的。然而，如果没有足够的气体，pCO2的水平会上升到不可接受的程度。据报道，CO2值>~150mm时汞柱会影响培养性能。CELLPIE Uniform-S 平台（货号GLE-6）生物反应器中的加料速率应该足以防止这个问题。
干细胞培养物可能会出现困难，但最近使用的生物反应器，其叶轮和容器配置对悬浮培养是有效的，在悬浮所需的最低速度（NJS）下，提供了良好的细胞生长和质量，这通常是CELLPIE Uniform-S 平台（货号GLE-6）生物反应器系列中可用的较低速度。原位细胞分离对收获是有效的，只要可以使用短时间更高强度的搅拌，那么这些生物反应器也就可以使用。当动物细胞在微载体上培养用于疫苗生产时，该技术也可能对传代有用。
下一步行动
本文所述设计和开发一次性搅拌罐生物反应器的方法，基于良好的工程原则，专注于每一个关键部件和功能，以确保最终产品可以为传统的不锈钢可清洁生物反应器提供一个可行的替代方案。传统圆柱形生物容器的几何形状，可以被一次性使用的立方体格式所取代，结合专门设计的叶轮、挡板和喷淋系统，可以提供与同等可重复使用的生物反应器相同或更高的性能。
计算机建模研究已经证实了特定功率输入、能量耗散率和混合时间，使立方体生物反应器的性能与圆柱体生物反应器相匹配。通过纳入与制造、处理和安装程序相关的额外功能，还可以确保一次性使用系统的坚固性和完整性。
一次性使用的工程CELLPIE Uniform-S 平台（货号GLE-6）生物反应器也考虑到了可扩展性的需要，从台式圆柱形10L生物反应器到200L和1000L立方体生物反应器的可扩展性能已经得到证明。基于五倍放大的成功和使用现代生物反应器设计与控制概念的基础，进一步扩大两倍规模的验证（目前正在进行）似乎是有把握的。
生物反应器只是完整的上游和下游生物处理系统中许多单元操作之一。传统可重复使用的不锈钢生物反应器的一次性替代品的出现，是将一次性单元操作整合到完全一次性工艺系统中的又一进步。
