摘要 pH值和溶解氧（DO）的浓度，是监测和控制培养研究中细胞生长的关键参数。在培养系统中实时测量这些参数的可靠、稳健和准确的方法，保证了产品的高产量和质量。这篇小型综述通过对测量原理和选定应用的简短介绍，总结了应用于从毫升到台式规模生物过程的pH和DO传感器的技术现状。特别强调的是一次性生物反应器，近年来在生物过程的开发和生产中越来越多地采用这种方法，给出了这些培养系统中传感器的工作原理、应用和特殊要求。在这些过程中，pH值和溶解氧的光学传感器通常比电化学探针更受欢迎，因为它们可以进行半侵入式的测量，并且可以微型化到微米级或更低。此外，还讨论了pH值和溶解氧的新型传感技术的部分测量原理。这些技术包括固态传感器和小型化设备，这些设备尚未在市场上销售，但在不久的将来有可能用于生物过程中，显示出良好的特性。
关键词 pH值和溶解氧的传感器•光学传感器•生物过程的测量和控制•一次性使用的培养系统
简介
现代生物工艺目前被用来开发和制造大量的产品，包括用于诊断和治疗严重疾病的高价值产品以及化妆品。这些产品包括单克隆抗体、激素、疫苗、生物活性细胞和组织，以及次级代谢物。生物工艺是无菌的，持续几天或几周，通常使用动物细胞系（哺乳动物和昆虫细胞）以及微生物、植物细胞培养物和最近的人类干细胞，作为生产往往是经过基因改造的生物体。为了充分挖掘生产生物体的潜力，培养系统（即生物反应器）必须确保细胞生长和产品形成的最佳条件，从而确保理想的产品数量和质量。
这包括测量和控制关键的工艺参数，如pH值和溶解氧（DO）值，并涉及工艺开发阶段、工艺特征和验证，最后是常规生产。pH和DO传感器是过程分析技术（PAT）的一部分，在细胞生长的同时，由于底物的消耗和副产品的形成，如乳酸、乙酸或乙醇，会产生自然的pH值变化。此外，在有氧生物过程中，细胞生长和生产阶段用于细胞呼吸的氧气，随着细胞数量（生物量）的增加而减少，代表存在于单位体积水中的细胞外溶解氧量的DO值影响细胞的吸氧率，是细胞活力的一个指标。非最佳的溶解氧/pH值，可能导致产品质量受损、细胞生长受限甚至死亡，因此产品浓度低，可能会损失一批产品。通过测量pH值和DO，可以检测到细胞凋亡的开始和污染存在。
如图1所示，对pH和DO传感器的具体要求，因生产生物体类型而异。由于代谢活动较高，与动物和人类细胞或植物细胞相比，微生物培养物中两种传感器的测量频率需要高得多。相反，用于微生物培养的pH和DO传感器，必须在较短的时间内提供可靠的性能，微生物细胞的pH传感器测量范围最广。到目前为止，独立于生产生物体的类型，发现DO测量比pH测量更有问题，这一点特别是有粘附细胞的过程、高细胞密度的过程和使用非牛顿培养液的培养过程，在这些过程中可能发生传感器膜表面的污损。值得一提的是，气泡向传感器的流动受限会影响DO传感器的信号接收。
图1现代有氧生物过程中使用的pH和DO传感器的主要具体要求，除了一般要求外，还需要考虑到这些要求。一般要求包括 (1)足够的灵敏度和特异性，(2)校准的需要，(3)机械坚固性，(4)稳定性，(5)易于使用和维护，(6)适合就地清洗和就地消毒，(7)易于验证和实施，(8)适当的反应时间。
这篇小型综述描述了pH和DO传感器的发展状况，这些传感器现在被用于从毫升到台式规模培养系统的生物过程中,它基于对目前市场上传感器的概述，对其工作原理的简短讨论以及对其优点和局限性的识别,给出了选定的pH和DO传感器及其在生物过程中的应用，并简要地总结了新出现的趋势。
生物过程中的pH和DO测量：技术现状
pH和DO的电化学传感器
迄今为止，传统的生物反应器（即带有玻璃或不锈钢培养容器的可重复使用的生物反应器）大多配备了pH和DO的电化学传感器。为了实现现场监测和控制，这些传感器直接安装在生物反应器容器上，这意味着这些设备需要经过就地清洗（CIP）和就地消毒（SIP）程序处理。
实验室和工艺应用中的在线和离线pH测量，仍然由pH玻璃传感器主导。电位计电极测量的是玻璃膜和参比电极之间形成的平衡电位。由于在几乎整个pH值范围内具有线性响应和高选择性，其测量性能非常出色。玻璃pH传感器是无菌工艺的良好选择，因为它们允许CIP和SIP程序。此外，生物相容性材料通常被用作润湿部件。
在传统的生物反应器中，溶解氧经常用安培电极（克拉克传感器）来测量，它已经成功使用了几十年。这些传感器是基于电化学反应，发生在相对于传感器阳极的恒定极化电位上，阳极主要由银组成。传感器的信号，即纳安培范围内的电流，受到分子氧通过气体渗透膜扩散的限制。克拉克型电极是坚固和长期稳定的传感器。然而，极化和更换电解液与传感器膜的维护工作是非常困难的，更换电解质和传感器膜的维护工作相对较高。此外，因为氧气被电化学还原反应所消耗，氧气浓度受到传感过程本身的影响，这种影响在大体积中可以忽略不计，但它会限制克拉克型电极的应用。由于这些原因，近年来许多传统的电化学溶解氧传感器已被相应的光学传感器所取代。
pH和DO的光学传感技术
光学pH传感器是基于固定在传感层上的pH指示染料（图2a），与应用于水溶液的pH指示剂类似，这些染料的碱性和酸性形式具有不同的光谱特性。因此，pH值的变化导致了这些分子质子化程度的变化，这反过来又可以被检测为吸光度或荧光信号的转移。已经提出了不同的技术来固定指示剂染料，如夹在溶胶-凝胶材料或聚合物中或与聚合物基体共价结合。
图2 光学传感器的测量原理a 光学pH传感器通常是基于嵌入聚合物基体的两种荧光染料的同时激发。当一种染料的荧光发射与pH值有关时，第二种染料则作为参考指标。通常使用参考检测技术，即比率强度测量或时域或频域的测量方案，如双寿命参考。 b 大多数光学氧传感器依赖于分子氧的选择性发光淬灭。如果使用调制的光源来激发染料，发射的强度和相位角取决于氧气浓度。
光学pH传感器的局限性，如其测量范围小、长期稳定性有限和对离子强度的依赖性，在过去几年中阻碍了其在生物过程中的广泛应用。然而，在过去的几年里，研究人员和传感器制造商不断改进其传感器的特性。由于与固定化pH指标的质子化平衡有关的工作原理的直接结果，光学pH传感器的测量范围通常限制在2-3个pH单位。由于大多数生物过程是在狭窄的pH范围内操作的（见表1），小的测量范围不一定是一个主要的制约因素。由于指示剂染料的测量范围由其pKa值决定，用于pH感应的染料可以根据指定的pH范围进行定制。通过将具有适当pKa值的pH指示剂应用于光学传感器，pH测量范围可以适应要监测过程的要求。作为一个例子，在丙酮、丁醇和乙醇的厌氧批量生产中，通过使用优化的pH值范围的传感器，成功监测了pH值在4.5-5.8范围内的传感器。如果具有不同pKa值的不同pH敏感染料被共同固定，传感器的动态范围可以被大大扩展。光学pH传感器的动态范围超过了5.5个pH单位的光学pH传感器已被报道。
表1 部分市售的pH和DO传感器及其主要特点。所举的例子特别关注一次性使用的传感器。
光学pH传感器会受到指示染料浸出和光漂白的影响，也会受到光源强度或检测器灵敏度波动的影响。已经采取了不同的措施，来改善光学pH传感器的信号稳定性，如使用光稳定的指示染料或将pH敏感染料共价连接到聚合物基体上。作为提高光学pH传感器长期稳定性的一个重要步骤，过去几年中开发了一种称为双寿命参考（DLR）的测量方案，这项技术也被应用于市面上的光学pH传感器中，如P公司的产品（表1）。在频域方案中，使用一个调制的光源，同时激发指示染料和第二个对pH不敏感的荧光染料，作为参考化合物。激发和发射信号之间的相移，与指示染料的质子化程度有关（因此也与测量溶液的pH值有关）。然而，这个信号是不受与所涉及的传感器化合物有限稳定性有关的非特异性效应的影响。
今天的光学pH传感器信号在几天或几周的培养过程中是足够稳定的(见表1)。然而，在操作过程中，测量信号往往需要进行校正，这通常是通过手工操作步骤完成的（取样、离线测量、测量值的偏移校正），这很费力，而且有污染的风险。
作为克拉克电极的替代品，光学传感器是在生物过程应用中，可靠测量溶解氧的成熟工具。如图2b所示，它们利用了固定在聚合物基质中的荧光染料，在氧气分子的存在下，染料的荧光发射被选择性地淬灭。因此，荧光强度随着分子氧分压的增加而降低。基于这一工作原理，不同类别的荧光染料已被开发出来，如过渡金属的多吡啶基络合物或金属卟啉。
商业上可用的光学氧传感器检测的不是荧光强度，而是在调制光源的激发和荧光染料的发射之间观察到的相位角的变化。使用这种方法，传感器的信号几乎不受光源的稳定性或染料的光漂白影响，从而允许非常可靠和长期稳定的测量。pH和DO的光学传感器贴片，被用于传统和一次性生物反应器中。显然，在过去15年中越来越多地实施一次性培养系统，对pH和DO传感器技术产生了强烈的影响。
用于毫升和升尺度的新型传感器
一次性使用与传统生物反应器：对传感器设计和规格的影响
一次性使用培养系统有一个透明或不透明的培养容器。塑料培养容器要么是刚性的（多孔板、T型瓶、试管、摇瓶和圆柱形一次性使用容器），由聚碳酸酯或聚苯乙烯制成，要么是用柔性袋操作，其接触层是聚乙烯或乙烯-醋酸乙烯。与可重复使用的同类产品相比，一次性使用的培养容器是经过测试版或伽马射线灭菌的，无需长时间准备即可使用。一次性使用后，它们就被丢弃了。
在一次性使用的培养容器中安装传感器，可能不会带来卫生风险，也不会对传质和流体力学产生不利影响（例如形成死区）。这一要求是传感器死区在毫升级难以避免的事实，或倾向于需要微型传感器解决方案，也适用于可重复使用的培养容器。但在污染风险降低的情况下，一次性培养系统应配备一次性传感器，而不是具有标准几何形状的可重复使用的pH和DO传感器（如12mm的传感器直径）。尽管可重复使用的pH和DO传感器仍在使用，但需要在容器外进行消毒，并通过无菌接头连接到一次性生物反应器上，这只能被视为一种妥协。
事实上，一次性使用的pH和DO传感器是最好的，其前提是即用型培养容器中安装了经过消毒、校准的合格传感器。一次性使用的传感器会产生浸出物，这是不可取的。浸出物显示的是培养容器的制造过程和辐照过程中产生的化学物质。在加工条件下，它们可以从塑料中迁移到含有细胞的培养液中，即使是小浓度的可浸出物，也会引起细胞生长的抑制甚至死亡。
一次性使用的pH和DO传感器需要尽可能的便宜，并且对环境安全。除了测量之外，它们还应该提供物理组件的识别信息以及关于寿命周期和校准的信息，这是基于这样的假设：数据（取决于需求）可以从控制系统中外部读出，并进行记录和处理。对于现行的《药品生产质量管理规范》（cGMP）的应用，一次性使用的pH值以及溶解氧传感器和控制系统也都需要是可鉴定的，这有助于通过使用标准化的通信协议（即插即用）整合到上级的过程控制系统中。
一次性使用的pH和DO传感器
迄今为止，光学传感器点可以附着在任何透明容器内，允许通过培养系统的墙壁读出信号。在这种设置中，低成本的传感元件（即光学传感器点）与光源和探测器分开，直接安装在孵化器摇床中的读出装置，便于调查微生物或细胞培养物的放大和缩小。因此，光学传感器非常适合监测摇瓶（图3）或台式生物反应器中的pH值。传感器点的小尺寸也保证了小规模生物反应器和摇瓶中的流体动力学不受笨重传感器的影响。
图3 在摇瓶中实现的光学pH和DO传感器。这种设置允许可靠的测量，并有助于节省筛选研究的时间。
由于传感器点可以微型化到毫升级或更低，它们被常规用于测量微孔板中的pH和DO。到目前为止，一次性使用培养系统中的pH和DO的测量，主要依赖于光学传感方法。不幸的是，保质期超过6个月的传感器不能由应用者选择（它们是由一次性培养容器的供应商假装的）。
最近，传感器制造商已经开始将微型pH玻璃传感器整合到一次性生物反应器使用的标准配件中（如1″Eldon James端口）。已经证明，＞25kGy的伽马辐照只对传感器的性能有轻微影响，平均偏移量为0.05个pH单位。经过12个月以上的干燥储存，工厂传感器的特性与工厂校准数据相比，在0.1个pH单位内保持不变。
固态pH传感器
离子选择场效应晶体管（ISFETs），是一种基本不可破坏的固态传感器，它由一个半导体元件组成，该元件上有一个pH敏感层，由无机氧化物如Ta2O5组成。ISFET pH传感器已经成功地应用于监测发酵过程，并用于测量沼气消化液的pH值。这些传感器的尺寸非常小，因此适用于微型生物反应器。尽管如此，ISFETs在生物过程中的应用还没有被广泛接受。半导体传感元件的无菌封装在技术上是可行的，但是技术要求很高，作为一个主要的缺点，因为硅基底在热苛性钠中的耐久性有限，ISFETs通常没有资格在CIP程序中进行处理。电容式EIS（电解质-绝缘体-半导体）场效应传感器，由于其简单的结构，它们在30次CIP循环后，显示出很小的pH敏感性变化。然而，伽马辐照会使传感器信号发生几个pH单位的偏移。
此外，一种不同类型的电化学固态传感器已被引入，它基于固定在工作电极中的氧化还原活性化合物。根据这些化合物的氧化还原电位，在工作电极上施加电位导致它们的还原或氧化，从而产生电流信号。作为一个传感器的工作原理，具有pH值依赖性和pH值无关的氧化还原电位物种被固定在传感层中。因此，在伏安法设置中，当施加的电位被扫描时，传感器测量两个信号峰值，峰值之间的电位差与pH值直接相关。伏安传感器通常在三电极设置中运行，因此需要一个参考电极，这与传统的pH传感器的方式相同。然而，与电位传感器相比，参比电极的电位可能不稳定，不会直接影响测量值。因此，这些传感器可以提供长期稳定和 "免校准 "的pH测量。这使得它们对生物过程中的在线pH测量具有吸引力。尽管已经尝试将这种技术商业化，但伏安法pH传感器还没有在市场上出现。
最近提出了一种为一次性生物制造过程开发的新型传感和信号转导方案。这些传感器基于无源射频识别（RFID）标签，附着在一次性培养系统上。当RFID传感器被外部读出设备读取时，会产生一个延伸到加工介质中的电场，并受到其介电特性的影响，这影响了RFID谐振天线的复杂阻抗，它被无线测量并与几个测量参数相关联，如电导率、pH值和温度。现有开发了一个类似的无线传感器，它基于一个谐振电路，由一个随温度变化的电阻器和一个随电压变化的电容器的平面螺旋形电感器组成。通过与电路连接的固态铱/氧化铱pH传感器和Ag/AgCl参比电极，观察到电路的谐振频率由于溶液的pH变化而发生了移动。该传感器被用于远程监测摇瓶中几天的发酵情况，精确度为0.08个pH单位。该传感器被用于远程pH这些传感器很有前途，因为它们可以实现无电池、无接触的多参数监测，而且成本很低。此外，同步数字识别可在整个生物处理工作流程中提供有关一次性使用部件（如生产日期、校准日期等）的额外信息。
光学传感器的发展
在过去的几年里，人们对用于光学化学传感器的荧光染料进行了广泛研究。新类型的指示染料已被报道，其吸收和发射的最大值在红色或近红外光谱范围内，这在生物应用中是有利的，因为生物分子在近红外区域的光谱干扰较低。此外，标准的低成本光源可以用来激发荧光染料。基于BF2-四芳基氮杂环丁烷的高光稳定性近红外pH传感器，其发射最大值在700nm以上，不同的pKa值覆盖1.5-13的pH范围。
最近还提出了基于铂和钯的苯并卟啉的光学氧传感器。这些传感材料被红光激发，在电磁波谱的近红外范围内显示出发射最大值。这些传感器基于共价结合在聚合物基体上的染料，具有高度的光稳定性。基于近红外发射染料的氧气光学传感器也可以在市场上买到。
微量升级的传感器
由于光学传感器可以微型化到微米和纳米级，出现了各种测量微环境中pH和DO的新方法。光学传感器非常适合在微流控系统（小型化分析系统或芯片技术）中测量这些参数，从而实现从皮升到微升的培养。
嵌入纳米粒子对pH值和溶解氧敏感的荧光染料的使用，为在毫升级及以下的空间上解决pH值和溶解氧问题提供了新的机会。基于纳米粒子的传感器可用于监测细胞外氧的各种应用，直径为350nm的纳米珠被掺入了近红外发射的铂(II)-苯卟啉。这些功能化的珠子被用来测量细菌培养中的氧气，并用于土壤细菌的微观毒理学调查。应用于微流控系统，该方法被证明有助于调查微流控段的生长和代谢活动。尺寸为12nm的荧光pH敏感纳米颗粒，被固定在传统的琼脂糖层中，作为荧光成像的感应层。在这个有点简单的设置中，通过获取由蓝光激发染料荧光培养皿的RGB图片，来监测大肠杆菌的生长和代谢。大小为几十微米的生物相容性氧感应珠，被用来监测细胞培养物中的局部浓度氧，氧气的空间测量，使得所使用的细胞培养微孔的几何和结构特征得以评估。
根据实验条件，这些纳米探针需要满足与宏观传感器不同的要求，如细胞毒性和与不同细胞与组织模型的兼容性。最近报道了一种基于水凝胶的纳米传感器，其pH值范围广泛，涵盖了所有活细胞的生理pH值范围，它包括三种不同的pH值敏感荧光染料和一种参考染料。该传感器提供了不同处理后HeLa细胞中溶酶体pH值波动的测量。
结论和展望
几十年来，pH和DO的在线测量一直由电化学传感器主导。由于其坚固性、低成本和可靠性，电位法玻璃pH电极和安培法DO传感器，至今仍是生物过程监测的良好选择。pH和DO的光学传感器已经有很多年的商业应用了，近年来，在生物技术应用中也得到了认可。
两个主要因素导致光学传感器越来越多的使用。首先，它们允许通过透明的容器壁进行半侵入性的、非接触式的测量，并在外部读取和处理信号，由于这个原因，光学传感器非常适合应用于一次性台式生物反应器、摇床和微孔板。其次，光学传感器可以以一种直接的方式微型化，达到毫升级或以下。因此，它们甚至注定要被应用于微流控系统，以时间或空间分辨率测量pH和DO，以及对这些参数进行细胞内监测。光学pH传感器的局限性，如长期稳定性受限和测量范围小，使其至今无法在实验室和工艺流程中得到广泛的应用。相比之下，今天的氧气光学传感器稳定、坚固，不受CIP和SIP程序的影响。光学氧 气传感器在不锈钢生物反应器中使用标准尺寸已经有一段时间了。
从在日常工作中应用传感器的用户角度来看，传感器的开发者和制造商应该解决以下问题：
- 光学pH传感器的操作寿命和稳定性，在数天至数周的培养期内并不令人满意。如果这些传感器的特性与DO光学传感器的特性相同，就可以实现更高的工艺可靠性和效率。
- 电化学和光学测量技术在同一过程中经常被交替或同时使用。由于它们的工作原理不同，这些传感器的测量信号可能会出现偏差。如果使用完全可追踪的程序和标准来校准传感器，不同传感方案之间的可比性可以得到改善。
- 在传统的玻璃或钢制生物反应器中，传感器是使用标准的工艺端口和连接器安装的。然而，在一次性使用生物反应器中，有各种工艺接头和测量协议。这一领域的标准化将有助于用户选择一个最能满足特定生物过程要求的传感器，而不受制造商的影响。
